苏慧伦于台北市，依次就读于台北市永春国小、台北市怀生国中、华冈艺校戏剧科。1990年她在朋友（柯一正）的介绍之下去试音，之后便与朱雀文化制作签约（由滚石唱片发行）。
1990年3月苏慧伦出道，发行首张专辑《追得过一切》，1994年苏慧伦与滚石唱片签约；1995年12月24日与陈小春声演香港电台“普通话戏中戏：的士情缘”（导演：利子良）；1996年发行专辑《LEMONTREE》；1997年08月发行国语专辑《傻瓜》；1996年与郭子共同举办演唱会“郭友慧”；1997年举办个人两场演唱会：“傻瓜无敌登陆地球”；1998年10月上旬与任贤齐、五月天赴昆明、上海、广州、成都等地举行演唱会。
2001年推出《恋恋真言》专辑后，苏慧伦开始从事戏剧演出；苏慧伦在1993年第一次参与了电影《只要为你活一天》演出；在2002年公视人生剧展《童女之舞》中突破演出女同志的角色；在2005年的《深海》饰演一名忧郁症患者；2008年，苏慧伦以电影《流浪神狗人》获得罗马亚洲电影节最佳女主角，成为从影15年来的第一个演技奖项。
2010年举办《我们的青春啊！》演唱会，参与《滚石30快乐天堂》演唱会。2013年8月演唱动画电影《昆塔：盒子总动员》的主题曲《不可能是不可能的事》与周华健“父女对唱”。